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高通量药物筛选技术是20 世纪80 年代后期形成的寻找新药的高新技术

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高通量药物筛选技术是 20 世纪 80 年代后期形成的寻找新药的高新技术。 经过十余年的实践,该技术体系不断发展和完善,成为目前寻找新药的重要手段。 高通量药物筛选采用的筛选方法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分 子水*的筛选模型,根据样品与靶点结合的表现,判断化合物的生物活性。 由于这 些筛选方法是在微量条件下进行,同时采用自动化操作系统,可以实现大规模的 筛选,因而称为高通量药物筛选。同一化合物不同模型筛选的活性数据以及由同 一模型不同化合物的活性数据归纳出的结构活性关系可以为药物的发现提供极 有价值的信息。在高通量药物筛选中,通过活性数据处理过程确定化合物的药物 活性,并为基于信息的药物发现过程准备准确、丰富的资料。

1 高通量药物筛选的基本条件

1.1 化合物样品库

高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选, 因此通过高通量 药物筛选发现先导化合物(leading compounds)的有效性取决于化合物样品库中 化合物的数量及其质量。化合物样品的数量是指不同样品的数量,化合物样品的 质量主要由化合物结构的多样性决定。许多活性反应基团(ractive groups)使初 筛的假阳性大量增加,剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。化合物样 品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。 人工合成又可分为常规化 学合成和组合化学合成两种方法。

1.2 高通量药物筛选的自动操作系统

自动化操作系统就是实验室自动化站, 其基本功能就是自动连续地完成实 验的基本操作, 即①加样; ②稀释;③转移;④混合, 其方式包括震荡, 也可 以用加样器反复吹洗混合;⑤洗板, 就是用适当的溶剂清洗微板; ⑥温孵;⑦ 检测, 反应体系与一种或多种检测仪器相连, 在反应完成后进行自动检测并自 动采集储存数据, 完成整个实验过程。

1.3 高通量药物筛选的数据库管理系统

高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选与高 通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担 4 个方面的功能。

样品库的管理功能:化合物样品库对进行高通量药物筛选的化合物样品的各 种理化性质进行存储管理"对每一个新入库的化合物进行新颖性分析排除结构雷 同的化合物,避免不必要的筛选"由于高度反应性基团增加了假阳性出现的几率, 样品库对新入库的化合物进行反应基团检测以去除这类化合物"。

生物活性信息的管理功能:生物活性库存贮每一化合物经过不同模型检测后 的结果,并根据多个模型的检测结果对化合物的生物活性进行综合评价。

对高通量药物筛选的服务功能:高通量药物筛选的工作量大,自动化程度高, 也涉及到许多繁琐的工作。 高通量药物筛选数据库管理系统对与药物筛选相关的 业务往来通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行管理,使高通量药物筛选 的各个环节程序化、标准化。

药物设计与药物发现功能:高通量药物筛选产生大量的化合物结构信息,随 着筛选的进行,生物活性信息也将大幅度提高。高通量药物筛选数据库管理系统 通过对同一模型不同的呈现阳性反应的化合物结构进行分析,找出其构效关系, 从而为药物设计提供参考。

高通量药物筛选的基本过程 2 高通量药物筛选的基本过程

根据以上分析,高通量药物筛选结果虽然多数情况下能够提供样品化合物作 用机制的信息,但并不能完全证明它对某种疾病具有防治作用。 因此,采用了高通 量药物筛选方法来发现药物,一般采取以下几个步骤:

2.1 初筛和复筛

药物的初筛和复筛就是在分子、细胞水*上筛选样品,证明某一样品对该靶 点具有药理活性(或亲和力) 。 初筛以后,选择具有活性的化合物,采用系列浓度, 进行同一模型的复筛,阐明其对该靶点的作用特点、 作用强度和量效关系,由此发 现活性化合物(样品) 。

2.2 深入筛选

深入筛选是在初筛和复筛的基础上,将得到的活性化合物在与初筛不同但相 关的分子、细胞模型作进一步的筛选。其筛选内容包括:活性化合物的选择性、 细胞毒性以及其它性质。经过深入筛选,可为比较全面*兰刍钚曰衔锏囊┯ 价值提供更充分的实验资料。 根据这些资料,并结合活性化合物的化学结构特点, 进行综合分析,确定在结构和作用方面具有新颖性和开发价值的化合物(样品) 作为先导化合物(Lead Compound) 。同时,也可以结合组织器官或整体动物模型, 证明其药理作用,为活性化合物提供更加充分的实验依据。

获得先导化合物以后,根据实际情况进行结构优化(根据资料也可以直接作 为药物候选化合物进行开发) ,即进行化合物结构的改造,以便得到活性更高、缺 点更少的活性物质。普通的结构优化手段是经过分子设*卸嘀盅苌锏暮 成。*年发展起来的组合化学技术为结构优化提供了强有力的手段。结构优化后 的化合物需要重复筛选过程,以得到高效的新化合物。

2.3 确证筛选

确证筛选(confirmatory screening) 是对深入筛选获得的先导化合物或优 化后的被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究。其内容包括药理作 用、药物代谢过程、一般毒性等多方面的筛选,以确定其开发前景。对符合药物 要求的样品,确定为“药物候选化合物(candidate compounds) ”,进入开发研究 程序,即临床前研究,为临床研究准备必要的资料。

3 高通量筛选的基本特点

3.1 符合药物发现的基本规律

由于高通量筛选依赖数量庞大的样品库,实现了药物筛选的规模化,较大限 度的利用了药用物质资源,提高了药物发现的机率,同时提高了发现新药的质量。

3.2 充分利用药用资源

高通量筛选采用的是细胞、分子水*的筛选模型,筛选实验是在微量筛选系 统中完成的,样品用量一般在微克级(μg) ,节省了样品资源,奠定了“一药多筛” 的物质基础,同时节省了实验材料,降低了单药筛选成本。

3.3 高度自动化操作

随着对高通量药物筛选的重视程度不断提高,用于高通量药物筛选的操作设 备和检测仪器都有了长足发展,实现了计算机控制的自动化。 自动化仪器的应用, 减少了操作误差的发生,提高了筛选效率和结果的准确性。

3.4 多学科理论和技术的结合

在高通量筛选过程中,不仅应用了普通的药理学技术和理论,而且与药物化 学、分子生物学、细胞生物学、数学、微生物学、计算机科学等多学*裘芙岷稀 这种多学科的有机结合,在药物筛选领域产生大量新的课题和发展机会,促进了 药物筛选理论和技术的发展。

4 高通量筛选的模型

4.1 基于反酵母双杂交系统的药物筛选模型

酵母反双杂交系统是从酵母双杂交系统发展而来的新型药物筛选系统。 酵母 双杂交系统已经成为研究蛋白-蛋白相互作用的一种成熟有效的遗传学方法。其 理论依据是,许多序列特异性的转录因子通过结合到 DNA 上游激活序列(UAS) 并在相应的启动子部位激活 RNA 聚合酶 II 而提高靶基因的转录效率。DNA 结合 和激活功能定位于 2 个互相分离的结构域内,分别称为 DNA 结合结构域(DB)和

DNA 激活域(AD) 。与转录因子无关的蛋白与蛋白间相互作用使得 DB 和 AD 在空 间上相互接*,从而重组形成一个有功能的转录因子。 因此,有功能转录因子的重 组可以总结为 DB2X 和 AD2Y,其中的 X、Y 可以是来自任何组织的蛋白质分子。将 酵母生长标记例如 LEU2 或者 HIS3 (分别参与了亮氨酸和组氨酸的合成) 置于含 有 DB 结合位点的启动子控制下,则 B2X 与 AD2Y 的相互作用会产生选择性生长优 势,从而在缺乏特定氨基酸的培养基上呈现小的菌落,据此可以确定大量蛋白间 的相互作用。

反酵母双杂交是基于酵母双杂交基础上的一种新型的药物筛选方法。 其理论 基础与酵母双杂交基本相似,区别在于其报告基因不同,反酵母双杂交系统中只 有在蛋白间相互作用被阻断时能够显示出选择性的生长优势。 在反酵母双杂交模 型中,野生型 DB2X 与 AD2Y 的相互作用将会导致对酵母细胞的细胞毒性或者致死 作用。因为在这个系统中,报告基因是一些毒性标记基因例如 URA3 (负选择) 。 在这个模型下,DB2X 与 AD2Y 的彼此分离能够促成生长优势,从而能够很方便地 验证一些相互作用缺陷型的等位基因或者一些阻断相互作用的小分子药物或者 小肽。目前已有多例成功报道,例如利用反酵母双杂交系统从人工合成的小分子 库中筛选出了一些具有钙离子通道阻断活性的小分子。

反酵母双杂交系统作为一种理想的高通量筛选系统,具有以下优点: (1) 该 系统中的酵母细胞能够繁殖,因此无需对靶分子进行耗时、耗力、耗财的生物纯 化过程,而且能够在相对短的时间内对大量的蛋白质进行测试。(2) 该系统是在 一个生物体环境内进行的,因此与体内环境较为接*。细胞通透性以及细胞毒作 用都作为参数在筛选过程中被考虑。而这一点恰恰可以弥补体外筛选实验的不 足。(3)基于该系统的筛选能够比较准确地分析蛋白间的相互作用。利用几乎完 全相同的步骤,不相关蛋白间的相互作用也可以进行测试,这就意味着许多蛋白 间相互作用能够同时进行。(4) 该系统能够与现有的高通量筛选兼容,从而可以

在 96 或 384 孔板上测试组合化学分子库中的化合物。 另外它还很容易与计算机 工作站等相结合,从而能够快捷地分析实验数据。

尽管反酵母双杂交系统是一种较为理想的高通量筛选模型,但仍然存在一些 缺陷,例如细胞膜通透性问题以及对药物浓度的要求超出了组合化学所能提供的 水*等。目前正在进行多种尝试以改进这些缺陷,如通过改变酵母的基因型从而 提高细胞膜的通透性,已取得了较为理想的效果。

4.2 基于细胞*台的药物筛选模型

基于细胞模型的高通量筛选模型根据作用方式的不同,可以分为基于靶标 (位于细胞膜上或者细胞内) 的筛选与基于细胞整体活性或功能变化的筛选。其 中前者作用位点明确、机制清楚,但前提是必须确切的了解靶标的生理功能及相 应的检测方法;后者则能直接反映整体细胞对药物作用的反应,譬如细胞毒性检 测、细胞增殖特性、生长周期等等,其缺点是对于药物的作用靶标、途径不明。 下面将介绍 4 种模型,前 3 种是基于确定靶标的筛选,最后 1 种是基于细胞整体活 性或功能变化的筛选。

4.2.1 离子通道筛选模型

离子通道是一类通过调节细胞内离子水*而发挥信息作用的大分子膜蛋白, 其结构和功能正常是细胞进行生命活动的基础。

目前,已知一些疾病的发生与离子通道的改变有关。如高血压是由于血管* 滑肌上的钙通道关闭不全,使过多的钙离子进入*滑肌细胞与钙调蛋白结合,* 滑肌过度紧张引发的一种疾病。钙通道阻滞剂可阻止钙内流,解除*滑肌持续紧 张状态,有望治疗高血压。钙通道阻滞剂的筛选依赖于离子通道筛选模型。除此 之外,癫痫、高血钾性周期性麻痹、老年性痴呆、偏头痛等诸多疾病与离子通道 也有一定的关系,因此,建立以离子通道为靶标筛选药物将有助于寻找出治疗这 些疾病的高效药物。

4.2.2 受体筛选模型

受体是位于细胞膜表面或细胞内具有特异识别和结合功能的蛋白组分,与激 素、神经递质、药物或自身活性物质等相互作用,转导细胞间信号,进而触发细胞 内相应的生物效应。

受体正常的调节及变化是维持细胞内环境稳定的重要因素,而受体的异常变 化则会导致疾病的发生。但是,因其他原因发生的疾病也可表现受体的改变。某 些癌基因的表达产物就是以异常受体的形式出现,除此之外,某些病理变化也可 诱导组织表达该组织以前不表达的新受体,这些受体都可以作为筛选药物的新靶 点,为疾病治疗提供新的线索。例如,血小板活化因子受体拮抗剂的筛选,而 PAF 能引起很多疾病,如同种移植排斥、胃肠道出血、心律失常、蛋白尿、心脏功能 衰竭等,但是 PAF 只有与其特异的受体结合后,才会引起疾病,因此建立 PAF 受体 细胞模型,从药库中寻找高效抑制 PAF 与其受体相结合的药物,就能抑制相关疾 病的发生。

4.2.3 报导基因筛选模型

报导基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,此类基因所表达的蛋白 活性已被确认。 报导基因筛选模型是利用基因工程技术将疾病相关基因与报导基 因相嵌合,导入模型细胞,观察药物对该基因表达的影响来筛选有效药物。 随着生 物学的发展,越来越多的孤儿受体被发现,这些受体有可能成为新的药物筛选靶 点,对于这些受体的配体及其信号转导的了解都有赖于报导基因筛选模型。

例如,Nagy SR 等介绍了 Ah (ary hydrocarbon) 受体(一个配基依赖的转录 E2GFP 因子) 激动剂的筛选,用一个包含完整 Ah 受体应答绿色荧光蛋白报导基 因的 Hep G2 细胞系,可筛选此受体的激动剂。Sharif 等利用荧光素酶报告基因 技术,筛选出了针对人体细胞瘤的抗蛋白激酶 C 增殖抑制剂。

4.2.4 细胞增殖筛选模型

细胞培养法通常是将不同稀释度的药物样品或药物标准品与特定依赖细胞 株在一定条件下共同培养一段时间,然后检测增殖细胞数,因其与药物的药理活 性成正比,所以以细胞增殖数目为量效指标的这种促进特定依赖细胞株增殖的方 法称为细胞增殖法。

细胞增殖筛选模型主要反映的是药物对细胞整体的作用,必须详细知道药物 的作用靶标、 作用途径以及相关的细胞因子,因此,该模型能用于靶标不明的药物 筛选。例如,Bedard 等人利用细胞增殖法高通量筛选出人类细胞巨化病毒的抑制 剂。除此之外,该模型主要用于抗肿瘤药物筛选。

4.3 基于动物*台的药物筛选模型

基于反酵母双杂交的高通量筛选模型和基于细胞*台的高通量筛选模型均 为体外模型,而有些药物虽然在体外模型中能够显示很好活性,但进入动物体内 检测时活性却大大降低,甚至无活性。 这主要是由于在人体或者动物体中,药物作 用的发挥除了必须具备药理活性以外,还与其吸收、分布、代谢、排泄(ADME) 情 况有关。有些药物虽然在体外具有很高的活性,但是由于脂水分配系数的问题, 导致机体难以吸收,或者不能正确地分布到作用靶位点,故体内活性急剧降低。

将动物体模型作为药物筛选模型是*年来刚刚发展起来的。 由于动物体的完 整性,解决了筛选药物的药理活性和对药物的 ADME 进行研究的问题。虽然该模 型目前还处于发展阶段尚未形成完善的系统,但是在针对某些疾病的研究方面已 经显示出重要作用。例如在筛选治疗 Huntington 病的药物时,采用了一种小鼠 模型,并获得了较好的效果。

尽管动物*台上的模型系统仍然处在初始阶段,但该系统进一步完善后将具 有极大的优越性,在药物的高通量筛选方面将发挥更大的作用。

5 高通量药物筛选检测技术

5.1 基于荧光的检测技术

药物靶标用荧光物质标记后,当被筛选药物与靶标相互作用时,引起相应荧 光强度改变,可推测药物与靶标的作用信息。 目前已存在相关的自动化检测技术, 如,流式细胞仪( Flow CytoMeter , FCM) 技术、荧光极化(fluorescence polarization , FP) 、荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer ,FRET) 等。

5.1.1 流式细胞仪( Flow CytoMeter , FCM) 是基于激光激发荧光的发光技 术之一。它可以在功能水*上对单细胞进行定量分析和分选,高速分析上万个细 胞,并能同时测得细胞中多个参数。除此之外, FCM 可用于药物的发现,受体药理 学及高通量筛选。Waller 等为了更好地了解细胞内与信号转导有关的大分子之 间的相互作用,利用流式细胞仪高通量分析了 G 蛋白偶联受体的配体。FCM 速度 快,非常适合做大数量统计,完全不用担心荧光淬灭的问题。 但是此技术只能检测 荧光的有无、强度的大小,无法提供空间定位信息。由于样品只被检测一次,因此 无法对同一个样品进行连续观察。

5.1.2 荧光极化(fluorescence polarization , FP) 又称荧光偏振,能够测 定结合到大分子标记探针旋转散射系数的变化,因此非常适用于研究分子间相互 作用,如受体-配基、蛋白-蛋白、DNA2 蛋白等,该技术能直接且及时的检测示踪 分子的结合/ 自由率。例如,国家重大科技专项“新药筛选*台研究”课题组科 研人员,将荧光偏振技术应用于药物筛选,建立了针对心血管系统药物靶点的两 种高通量药物筛选模型,用于筛选治疗心血管疾病的药物。

5.1.3 荧光共振能量转移( fluorescence resonance energyt ransfer ,FRET) 原理是当两个荧光发色基团在足够靠*时,供体分子吸收一定 频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互 作用,实现了能量向邻*的受体分子转移。例如, Robers 等建立了哺乳动物细胞 高通量筛选,并将 FRET 用于该实验的靶点特异性转译后修饰的研究。而 VIPRTM 是根据细胞去极化前后的荧光比率(470nm/ 560nm) 来间接反映细胞膜电压的变

化,基于 FRET 技术,检测大分子与配体的结合能力,在配体受体结合后,由于分 子间的相互作用导致配体或者受体上携带的荧光基团的发光强度或方向等发生 变化从而导致荧光变化。 此技术现在已经广泛用于基于离子通道模型上的高通量 药物筛选。孙丽新等在 2006 年建立了以 VIPRTM 为染料的钾离子通道高通量筛 选模型,该模型具有良好的稳定性和特异性,使基于离子通道的筛选实现了高通 量。

5.2 基于化学发光的检测技术

化学发光(Chemiluminescence , CL) 检测技术是自然界中的一种依赖化学 反应产生的光辐射确定物质中痕量分子的方法,此法具有高灵敏度和宽的动态范 围(3~6 个数量级) 、仪器简便、不存在空白、易于实现自动化、微型化,而且 可以在 1536 孔板上进行等诸多优点,因此在需要进行大量快速初选工作的新药 筛选中,得到了广泛的应用。例如,1999 年刘峻等利用生物化学发光法筛选出能 清除活性氧的天然药物。

报导基因技术就是基于化学发光的原理,将细胞表面或细胞内低的背景信号 放大,得到一个高灵敏度、易检测的信号。所以该技术在高通量筛选中具有较高 的可靠性、可重复性、敏感性和适用性,非常适合于以细胞为基础的体外生化分 析。除此之外,报导基因的活性可以在培养的活细胞中保持几个星期甚至更长, 这就可以对药物的耐药性和副作用做长期观察。

5.3 基于放射性活性检测技术

目前基于放射性的检测技术有很多,现主要介绍以下两种。

亲和闪烁分析 ( Scintillation Proximity , SPA) 在细胞表面受体药物筛 选中应用较广泛,该检测方法的原理是通过亲和结合将放射配基结合到具有受体 的闪烁球上,从而产生光子,减少放射配基标记分析中游离配基与结合配基的结 合过程,使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行,在更大程度上适应基于

细胞膜型的高通量药物筛选。 SPA 技术无需繁琐的分离步骤,它不仅是配体-受体 相互作用的理想检测技术,也适应于免疫测定。 另外,此技术也曾被用来研究过氧 化物酶体增殖激活受体的配体筛选。

荧光成像读板仪( fluorescence image platereader ,FL IPR)在短间内可 以同时检测荧光的强度和变化、 测定细胞内钙离子浓度、 检测离子通道以及 G 蛋 白偶联受体。此项技术已用于确定孤儿 G 蛋白偶联受体的同源配体,具有极强实 时性,易于实施的优点,但是这种筛选方法需要耗费大量人力,而且只局限于 96/ 384 孔板。

应用高通量药物筛选方法发现创新药物,也存在许多尚未解决的问题,如体 外模型的筛选结果与整体药理作用的关系,对高通量药物筛选模型的评价标准, 筛选模型的新颖性和实用性的统一以及新的药物作用靶点的研究和发现等,仍然 是目前药物筛选领域研究的重要课题, 但是,高通量药物筛选的广泛应用,正促进 创新药物的发现和研究开发进程。

高通量药物筛选方法现在已经广泛地应用于国内新药的开发研究中, 列出以 下文献,谨供同学们参考。

1 孙婉, 李敏魏少荫等,以微管蛋白为靶的高通药物筛选方法的建立与应用,中 国新药杂志[J],2006,25(21):1828-1831;

2 何新益,刘仲华,刘金福,高通量筛选法对苦瓜中降血糖活性成分的研究,天 津 农 学 院 学 报[J],2007,14(4):29-32;

3 郎廷元,晏菊芳,胡昌华,P-gp 蛋白功能抑制剂高通量筛选模型的建立与应用, 中国药理学通报[J],2007,23 (10) : 1396~9;

4 刘志学, 俞佳玲,MC1R 拮抗/ 激动剂高通量筛选体系的建立,同济大学学报 [J],2007,28(3):112-116




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